影响微生物限度检查方法验证结果有哪些因素？

　　结合工作实践，对微生物限度检查方法验证过程中的问题进行分析，并提出合理化建议，以使验证方法能保证污染供试品的微生物被充分检出。

　　为使微生物限度检查方法更加科学、完整，2005年版《中国药典》规定：在建立供试品的微生物限度检查法或检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果时，应对检查法的可靠性进行方法验证，，在其供试品3次独立的平行试验中，细菌、霉菌及酵母菌的回 收率均应达70%以上，控制菌检查方法验证的试验组应检出试验菌，阴性菌对照组不得检出，否则不符合验证试验要求，应建立新方法并重新验证。但方法验证周期长，程序烦琐，干扰因素多，若控制不当则难以达到标准要求。影响微生物限度检查方法验证结果有哪些因素？现就方法验证过程中易影响结果的几个原因分析如下。

　　1、药品的抑菌或杀菌性成分

　　笔者在口服中成药和西药的微生物限度检查中发现，相当多的品种(如三黄片、牛黄解毒片、阿加盼散、维生素B2片等)具有抑菌作用，其微生物限度检验结果是否准确，主要取决于供试品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖。在检验前或检验过程中，应排除其抑菌作用，使之不干扰微生物限度检查，这样所得结果才有效。

　　对于供试药品的抑菌性，国外药典规定在检查前先通过试验加以确定，并对供试品进行处理，消除抑菌作用影响后再进行检查。在我国药典中，供试药品的抑菌性是根据不同稀释度的菌数变化和控制菌的阳性对照试验是否正常生长来判断的。 在试验中，低稀释级抑制菌不生长或少生长而高稀释级才生长的情况并不少见，这给方法验证带来了难度。

　　2005年版《中国药典》的方法验证一般是采用最低稀释级的供试液对规定菌株进行逐一验证，但若抑菌作用未消除或消除不完全，其回收率就很难达到要求。因此，在方法验证前判定供试药品是否存在抑菌或杀菌性是方法验证是否成功的关键因素之一。在试验前应先对供试药品处方进行分析，然后作预试验，根据预试验结果采用最简单、最易操作的方法进行验证。如选择标准上所规定的方法消除最低稀释级的供试液的抑菌活性，仍不能使试验菌的回收率达到方法验证的要求时，应根据供试品的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，采用高一级稀释供试液重新进行回收率测定，当试验菌的回收率达到计数方法验证的要求时，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液。

　　2、标准菌株的保存及菌液的制备、贮期

　　药品微生物限度检查对象具有以下特征：属能繁殖的活细胞生物，活性易变性;数量少且分布不均匀;多数处于受损状态;生存 环境具多样性及复杂性。验证试验中使用的标准菌株形态变异、 菌落变异、耐药性变异等均可使细菌丛集或分散不均，从而造成计数误差大，影响验证结果。

　　因此，在方法验证中所采用的标准菌株其生物学特性必须典型、稳定，对试验菌种的保存，应采用适宜的方法和技术，以防试验菌株变异，所用菌种的传代次数按规定不得超过5代，所制备的菌液贮期不能太长，菌数应达到药典要求。

　　3、操作环境不符合规定

　　按微生物限度检查要求，无菌室应由无菌操作间和两个缓冲间组成，操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，操作间和缓冲间的门不应直对，每个无菌室应有独立的空气净化系统;环境洁净度不应 低于10000级，其操作点或净化工作台的净化级别应达到100级。 笔者曾发现，在净化工作台启动的情况下，有3批同一样品在验证试验中回收率重现性差，后经分析发现是净化工作台不合格造成 的。因此，应加强无菌室的清洁、维护和保养工作，定期检测元菌操作台及净化工作台的洁净度，对不合格者应及时处理。

　　4、操作误差

　　操作不熟练，实验环节控制不严格，或实验操作不够严谨，均会给试验结果带来很大影响。如放供试液或菌液入皿时每1 mL未完全放尽;所加菌液计数不准确;在验证细菌、霉茵及酵母菌计数 方法时，样品及菌液注皿后未立即倾注培养基，由于样品的活性作用造成前面的平皿与后面的平皿的细菌误差大。

　　因此，在操作中， 所取制备菌液的单位体积菌数比标准规定的要稍高些，以减少加在样品中的菌液体积。应将0.4-0.6mL菌液加在平皿中部，避免其流动，然后立即加入培养基，最好有两人操作，以减少皿与皿间的试验菌数误差。

　　5、培养基灵敏度下降

　　为了方便，很多单位在试验中都使用干粉培养基，但干粉培养基极易吸潮，存放不当会出现凝块，使凝固性变差，所以，要注意干粉培养基的贮存和保管。用电炉直火加热熔化培养基或将剩余的 培养基冷藏后再熔化使用，均很容易破坏培养基中的营养成分，并直接影响菌回收率。

　　6、灭菌方法不当

　　高压消毒灭菌法是最常用、最有效的灭菌方法。为了保证高压灭菌的质量，达到高压消毒的目的，在进行高压灭菌消毒时，首先要选择合格的压力蒸气灭菌器，其次操作人员必须了解灭菌器的原理并遵守其操作规程，选择经验证合格的灭菌程序。消毒时要特别注意排尽锅内的冷空气，否则压力虽然达到了要求，温度却达不到要求，灭菌就可能不彻底。

　　同时，应根据消毒物品的特性确定合理的灭菌时间和温度： 一般情况下，含有糖分的培养基温度须控制在 115℃，保持15-20min：不含糖分的培养基温度应控制在121℃， 保持15-20min;而含菌的培养基(使用过的)温度须控制在121℃， 保持30min左右。每次使用时，都应有必要的监视指标。

　　7、菌落计数误差

　　在方法验证中，对试验菌组的菌落计数应仔细观察，对供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等要严格区分，对可影响计数的供试品， 在进行方法验证前，应先将对结果有影响的药渣除掉。

　　总之，对药品的微生物限度检查，应采用经过验证的方法，且操作者须有一定的理论和实践经验，严格按操作规范进行，这样才能减少或避免对方法验证结果造成的误差。